{
  "abstract": "Introdução: A anemia falciforme (AF) é uma doença genética caracterizada pela polimerização da hemoglobina S (HbS) desoxigenada, anormalidade estrutural dos eritrócitos, episódios de oclusão da microcirculação e dano progressivo aos órgãos. O aumento dos níveis de hemoglobina fetal (HbF) reduz a polimerização da HbS e a gravidade da doença, tornando sua indução uma das principais estratégias terapêuticas para a AF. Variantes localizadas na região promotora dos genes da gama-globina (HBG1/HBG2), responsáveis pela persistência hereditária da hemoglobina fetal não-delecional (PHHF), incluindo a mutação brasileira HBG1 -195 C>G, estão associadas à manutenção da expressão de HbF na vida adulta. Objetivo: Neste estudo, tivemos como objetivo avaliar uma estratégia de edição gênica baseada em CRISPR/Cas9 direcionada ao promotor dos genes HBG1/HBG2 como estratégia para reativar a expressão de HbF na linhagem eritroide HUDEP-2. Material e Métodos: Complexos ribonucleoproteicos (RNPs) foram montados utilizando a nuclease Alt-R™ S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 e dois RNAs guias de fita simples (sgRNAs) específicos para a sequência-alvo. Os complexos RNP foram coeletroporados com um molde de DNA doador contendo a substituição -195 C>G em 1×10⁶ células HUDEP-2, utilizando o sistema Lonza 4D-Nucleofector™. As células controle consistiram em células submetidas apenas à eletroporação, enquanto os grupos experimentais receberam o DNA doador em conjunto com os complexos RNP contendo o sgRNA1 ou o sgRNA2. As células positivas para HbF foram quantificadas por citometria de fluxo 96 horas após a eletroporação, e os níveis de expressão de mRNA de HBG1/HBG2 e β-globina (HBB) foram determinados por PCR quantitativa em tempo real (qPCR). Resultados: A análise comparativa demonstrou desempenho superior do sgRNA1, que gerou 51,2% de células positivas para HbF, em comparação com 30,9% obtidos com o sgRNA2. De forma consistente, o sgRNA1 promoveu um aumento de aproximadamente 13 vezes na expressão de HBG1/HBG2 em relação às células controle (1,49 vs. 0,11 unidades arbitrárias – U.A.), enquanto o sgRNA2 induziu um aumento de 3,9 vezes (0,44 vs. 0,11 U.A.). Em contrapartida, em comparação aos controles, a expressão de HBB diminuiu aproximadamente 4 vezes com o sgRNA1 (0,37 vs. 1,68 U.A.) e 1,6 vez com o sgRNA2 (1,00 vs. 1,68 U.A.), indicando maior produção de HbF pelo sgRNA1 acompanhada por uma redução compensatória da expressão da β-globina. Considerando que a eficiência de edição ainda não foi confirmada por sequenciamento, a indução de HbF observada provavelmente reflete uma população heterogênea de células, composta por produtos de reparo gerados por recombinação homóloga (HDR), produtos de reparo gerados por junção de extremidades não homólogas (NHEJ) e células não editadas. O sequenciamento em andamento da região promotora de HBG1/HBG2, aliado ao isolamento clonal, permitirá determinar a frequência da edição desejada (-195 C>G) e estabelecer sua contribuição específica para a reativação da HbF. Conclusão: Esses resultados preliminares demonstram que a edição gênica mediada por CRISPR/Cas9, direcionada à região promotora dos genes da gama globina, é capaz de induzir a expressão de HbF em células HUDEP-2. Além de fornecer evidências iniciais do potencial terapêutico da estratégia, esses achados comprovam a viabilidade técnica da plataforma de edição gênica já estabelecida pelo grupo.",
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    "Centro de Hematologia e Hemoterapia, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brasil",
    "Department of Research and Development, Central Blood Institute, Blood Service Headquarters, Japanese Red Cross Society, Tokyo, Japan",
    "Cell Engineering Division, RIKEN BioResource, Research Center, Ibaraki, Japan"
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  "arxiv": null,
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