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  "abstract": "Introdução: A mutação JAK2V617F é a principal alteração molecular associada às neoplasias mieloproliferativas Philadelphia-negativas (NMPs Ph-); tem papel central na ativação constitutiva da via JAK-STAT e na expansão clonal das células hematopoéticas. A quantificação da carga alélica dessa mutação apresenta relevância diagnóstica e prognóstica, sendo atualmente recomendada a utilização de métodos com sensibilidade de no mínimo 1% de carga alélica. Objetivo: Avaliar o desempenho analítico de um ensaio de PCR em tempo real (qPCR) in house para quantificação da mutação JAK2V617F. Métodos: Foi utilizado um ensaio TaqMan® com sondas específicas para os alelos JAK2V617F selvagem e mutado. A exatidão foi avaliada em 44 amostras de DNA extraídas de sangue periférico ou aspirado de medula óssea, previamente caracterizadas por qPCR (n=37) e sequenciamento de nova geração (NGS) (n = 7), sendo 10 negativas e 34 positivas. A linearidade foi avaliada a partir de diluições seriadas (1:3) de uma amostra positiva com carga alélica de 91,62%. O limite de detecção (LoD) foi determinado por meio da análise de amostras contendo aproximadamente 1% e 0,15% de frequência alélica em 20 replicatas. A precisão foi avaliada utilizando amostras com frequências alélicas alvo de 10%, 5%, 1% e 0,5%. Resultados: Entre as amostras positivas utilizadas no teste de exatidão, 84,6% apresentaram cargas alélicas entre 1% e 9%, enquanto 15,4% apresentaram valores inferiores a 1%. Foi observada boa concordância de resultados entre as amostras positivas, destacando-se as amostras com valores de carga alélica entre 1% a 5% testadas previamente por NGS. Foi observada concordância qualitativa de 100% entre as amostras negativas. Na avaliação da linearidade, observou-se forte correlação entre os valores esperados e observados, com coeficiente de determinação próximo de 1 (R2 = 0,9999). O estudo do LoD demonstrou detecção reprodutível em torno de 1%, com média de 1,47% e coeficiente de variação (CV) de 10,36%. Em contrapartida, a concentração de 0,15% apresentou média de 0,03%, CV de 61,38% e perfil de amplificação indistinguível dos controles negativos. Na análise da precisão, os valores de CV para as frequências alélicas de 10%, 5% e 1% foram 4,10%, 5,03% e 13,78%, respectivamente. As replicatas apresentaram CV inferior a 20%, demonstrando variabilidade adequada para a quantificação da carga alélica de JAK2 V617F. O nível de 0,5% apresentou CV de 31,75%, indicando elevada variabilidade analítica nessa faixa. Conclusão: O ensaio in house de qPCR apresentou desempenho analítico adequado para a quantificação da mutação JAK2V617F, demonstrando exatidão, linearidade e precisão satisfatórias para frequências alélicas iguais ou superiores a 1%. Os resultados sustentam sua aplicação na rotina diagnóstica das NMPs Ph-, atendendo às recomendações internacionais para detecção de baixas cargas alélicas.",
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    "Grupo Fleury, São Paulo, SP, Brasil"
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