VALIDAÇÃO DE ENSAIO MULTIPLEX RTQPCR ONE-STEP PARA O DETECÇÃO QUALITATIVA DE TRANSLOCAÇÕES RECORRENTES NA LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA B
- 1Hospital da Criança de Brasília José Alencar, Brasília, DF, Brasil
Abstract
Introdução: As leucemias agudas são neoplasias hematológicas caracterizadas pela proliferação de precursores hematopoéticos imaturos. Na infância, a leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B) representa aproximadamente 80% dos casos de leucemia. Alterações cromossômicas recorrentes desempenham papel relevante na leucemogênese, na classificação e na evolução clínica da doença. Entre as alterações mais frequentes na LLA-B estão a hiperdiploidia e as translocações t(12;21), t(4;11), t(1;19) e t(9;22). A identificação dos genes de fusão resultantes dessas translocações contribui para a classificação molecular, a estratificação prognóstica e, em alguns casos, para a definição de estratégias terapêuticas. Nesse contexto, a RT-qPCR multiplex permite a detecção simultânea de diferentes genes de fusão em uma única reação, com rapidez, sensibilidade e menor número de etapas quando comparada à RT-PCR convencional seguida de eletroforese. Objetivos: Desenvolver e validar um ensaio de RT-qPCR multiplex para a detecção qualitativa das principais translocações recorrentes em leucemias agudas pediátricas. Materiais e Métodos: Os procedimentos laboratoriais foram realizados no Laboratório de Pesquisa Translacional do Hospital da Criança de Brasília José Alencar. Os primers e sondas foram selecionados com base no estudo de Gabert et al. (2003) e organizados em reações multiplex utilizando fluoróforos distintos, permitindo a detecção simultânea de genes de fusão e do controle endógeno. O ensaio foi estruturado em dois tubos independentes, cada um contendo alvos específicos para duas translocações e o gene ABL1 como controle endógeno. Para a avaliação do ensaio, foram utilizadas amostras de pacientes com translocações previamente identificadas por metodologias de referência. Também foram empregados controles plasmidiais contendo insertos correspondentes às regiões de interesse de cada fusão, clonados em vetores pGEM-T Easy. Resultados: Todas as amostras positivas apresentaram amplificação dos respectivos genes de fusão e do gene ABL1. Não foi observada amplificação específica nos controles negativos. Esses resultados demonstraram adequada capacidade de detecção dos alvos avaliados e ausência de interferência dos alvos multiplexados na mesma reação. Discussão: O ensaio desenvolvido permitiu detectar translocações recorrentes associadas à LLA-B pediátrica. A estratégia apresenta potencial para simplificar a implantação do diagnóstico molecular em laboratórios que já dispõem de plataformas de PCR em tempo real, frequentemente utilizadas para diagnóstico molecular de doenças infecciosas, mas que ainda não realizam investigação molecular de neoplasias hematológicas. Em comparação com protocolos de RT-PCR convencional, a abordagem também reduz etapas laboratoriais, ao integrar a transcrição reversa e a amplificação em um mesmo fluxo e dispensar a análise dos produtos por eletroforese em gel. Essa simplificação pode reduzir o tempo de execução, a manipulação das amostras e a possibilidade de erros operacionais. Conclusão: O ensaio de RT-qPCR multiplex desenvolvido mostrou-se capaz de detectar qualitativamente as translocações avaliadas e apresenta potencial para tornar a investigação molecular da LLA-B pediátrica mais rápida, prática e acessível à rotina laboratorial.
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BibTeX
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PY - 2026
DA - 2026/10/23
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AB - Introdução: As leucemias agudas são neoplasias hematológicas caracterizadas pela proliferação de precursores hematopoéticos imaturos. Na infância, a leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B) representa aproximadamente 80% dos casos de leucemia. Alterações cromossômicas recorrentes desempenham papel relevante na leucemogênese, na classificação e na evolução clínica da doença. Entre as alterações mais frequentes na LLA-B estão a hiperdiploidia e as translocações t(12;21), t(4;11), t(1;19) e t(9;22). A identificação dos genes de fusão resultantes dessas translocações contribui para a classificação molecular, a estratificação prognóstica e, em alguns casos, para a definição de estratégias terapêuticas. Nesse contexto, a RT-qPCR multiplex permite a detecção simultânea de diferentes genes de fusão em uma única reação, com rapidez, sensibilidade e menor número de etapas quando comparada à RT-PCR convencional seguida de eletroforese. Objetivos: Desenvolver e validar um ensaio de RT-qPCR multiplex para a detecção qualitativa das principais translocações recorrentes em leucemias agudas pediátricas. Materiais e Métodos: Os procedimentos laboratoriais foram realizados no Laboratório de Pesquisa Translacional do Hospital da Criança de Brasília José Alencar. Os primers e sondas foram selecionados com base no estudo de Gabert et al. (2003) e organizados em reações multiplex utilizando fluoróforos distintos, permitindo a detecção simultânea de genes de fusão e do controle endógeno. O ensaio foi estruturado em dois tubos independentes, cada um contendo alvos específicos para duas translocações e o gene ABL1 como controle endógeno. Para a avaliação do ensaio, foram utilizadas amostras de pacientes com translocações previamente identificadas por metodologias de referência. Também foram empregados controles plasmidiais contendo insertos correspondentes às regiões de interesse de cada fusão, clonados em vetores pGEM-T Easy. Resultados: Todas as amostras positivas apresentaram amplificação dos respectivos genes de fusão e do gene ABL1. Não foi observada amplificação específica nos controles negativos. Esses resultados demonstraram adequada capacidade de detecção dos alvos avaliados e ausência de interferência dos alvos multiplexados na mesma reação. Discussão: O ensaio desenvolvido permitiu detectar translocações recorrentes associadas à LLA-B pediátrica. A estratégia apresenta potencial para simplificar a implantação do diagnóstico molecular em laboratórios que já dispõem de plataformas de PCR em tempo real, frequentemente utilizadas para diagnóstico molecular de doenças infecciosas, mas que ainda não realizam investigação molecular de neoplasias hematológicas. Em comparação com protocolos de RT-PCR convencional, a abordagem também reduz etapas laboratoriais, ao integrar a transcrição reversa e a amplificação em um mesmo fluxo e dispensar a análise dos produtos por eletroforese em gel. Essa simplificação pode reduzir o tempo de execução, a manipulação das amostras e a possibilidade de erros operacionais. Conclusão: O ensaio de RT-qPCR multiplex desenvolvido mostrou-se capaz de detectar qualitativamente as translocações avaliadas e apresenta potencial para tornar a investigação molecular da LLA-B pediátrica mais rápida, prática e acessível à rotina laboratorial.
SN - 2531-1379
SN - 2531-1387
ER -