QUIMIOGENÔMICA FUNCIONAL BASEADA EM CRISPR/CAS9 IDENTIFICA DETERMINANTES GENÉTICOS DA RESPOSTA À CROMOMICINA A2 EM LEUCEMIAS AGUDAS
- 1Departamento de Clínica Médica, Divisão de Hematologia, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP, Brasil
- 2Departamento de Farmacologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP, Brasil
- 3ChemoGenix CRISPR Screening Platform, Institute for Research in Immunology and Cancer, Université de Montréal, Canadá
Abstract
Introdução: A manutenção da homeostase celular depende da integração entre programas de transcrição gênica, progressão do ciclo celular, adaptação ao estresse e morte celular programada. A desregulação desses processos constitui uma característica central das leucemias agudas e representa uma oportunidade para a identificação de novas vulnerabilidades terapêuticas. A cromomicina A2, membro da família dos ácidos aureólicos, liga-se a regiões ricas em GC do DNA e interfere na regulação transcricional, porém seus mecanismos de ação em neoplasias hematológicas permanecem pouco compreendidos. Objetivos: Identificar determinantes genéticos responsáveis pela resposta celular à cromomicina A2 em leucemias utilizando rastreamento genômico por CRISPR/Cas9. Material e métodos: Células NALM6 expressando Cas9 induzível foram transduzidas com uma biblioteca CRISPR/Cas9 contendo 278.754 sgRNAs direcionados a todo genoma (RefSeq). Após indução das deleções gênicas por doxiciclina, as células foram cultivadas na ausência ou presença de cromomicina A2 (0,7 nM). O crescimento celular foi monitorado periodicamente, seguido de extração de DNA genômico, amplificação das sequências de sgRNAs, sequenciamento de nova geração e análise dos resultados pelo algoritmo CRANKS. Os resultados foram integrados aos estudos funcionais previamente realizados, incluindo viabilidade celular, apoptose, clonogenicidade, microscopia eletrônica, expressão gênica e immunoblotting. Resultados: A cromomicina A2 apresentou potente atividade antileucêmica em modelos celulares, induzindo remodelamento autofágico precoce, atraso na progressão da fase S, apoptose e acúmulo de γH2AX. O rastreamento por CRISPR identificou genes cuja perda aumentou significativamente a sensibilidade à cromomicina A2, destacando componentes das vias de reparo de DNA por excisão de nucleotídeos (ERCC1, ERCC4, ERCC5 e XPA), resposta ao estresse replicativo (SLFN11), apoptose mitocondrial (APAF1, BAK1 e CASP9), proteostase (FAF2, MBTPS2, UBQLN1, PLAA e RTCB) e metabolismo celular (GFPT1, GMPPB, KDSR, SLC4A7 e AHCYL1). Esses resultados indicam que múltiplos processos celulares contribuem para a resposta citotóxica induzida pela cromomicina A2. Discussão: A identificação de genes envolvidos no reparo de DNA, apoptose, proteostase e metabolismo demonstra que a atividade antitumoral da cromomicina A2 depende da integração de diferentes vias responsáveis pela manutenção da homeostase celular. Esses achados corroboram os resultados funcionais obtidos anteriormente e fornecem novas evidências sobre os mecanismos moleculares associados à resposta ao tratamento. Conclusão: O rastreamento funcional por CRISPR/Cas9 revelou vulnerabilidades genéticas associadas à resposta à cromomicina A2 em leucemias agudas, destacando vias de reparo de DNA, estresse celular e apoptose como determinantes da sensibilidade ao composto. Esses resultados ampliam a compreensão do mecanismo de ação da cromomicina A2 e identificam potenciais biomarcadores e alvos terapêuticos para futuras estratégias em neoplasias hematológicas.
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AB - Introdução: A manutenção da homeostase celular depende da integração entre programas de transcrição gênica, progressão do ciclo celular, adaptação ao estresse e morte celular programada. A desregulação desses processos constitui uma característica central das leucemias agudas e representa uma oportunidade para a identificação de novas vulnerabilidades terapêuticas. A cromomicina A2, membro da família dos ácidos aureólicos, liga-se a regiões ricas em GC do DNA e interfere na regulação transcricional, porém seus mecanismos de ação em neoplasias hematológicas permanecem pouco compreendidos. Objetivos: Identificar determinantes genéticos responsáveis pela resposta celular à cromomicina A2 em leucemias utilizando rastreamento genômico por CRISPR/Cas9. Material e métodos: Células NALM6 expressando Cas9 induzível foram transduzidas com uma biblioteca CRISPR/Cas9 contendo 278.754 sgRNAs direcionados a todo genoma (RefSeq). Após indução das deleções gênicas por doxiciclina, as células foram cultivadas na ausência ou presença de cromomicina A2 (0,7 nM). O crescimento celular foi monitorado periodicamente, seguido de extração de DNA genômico, amplificação das sequências de sgRNAs, sequenciamento de nova geração e análise dos resultados pelo algoritmo CRANKS. Os resultados foram integrados aos estudos funcionais previamente realizados, incluindo viabilidade celular, apoptose, clonogenicidade, microscopia eletrônica, expressão gênica e immunoblotting. Resultados: A cromomicina A2 apresentou potente atividade antileucêmica em modelos celulares, induzindo remodelamento autofágico precoce, atraso na progressão da fase S, apoptose e acúmulo de γH2AX. O rastreamento por CRISPR identificou genes cuja perda aumentou significativamente a sensibilidade à cromomicina A2, destacando componentes das vias de reparo de DNA por excisão de nucleotídeos (ERCC1, ERCC4, ERCC5 e XPA), resposta ao estresse replicativo (SLFN11), apoptose mitocondrial (APAF1, BAK1 e CASP9), proteostase (FAF2, MBTPS2, UBQLN1, PLAA e RTCB) e metabolismo celular (GFPT1, GMPPB, KDSR, SLC4A7 e AHCYL1). Esses resultados indicam que múltiplos processos celulares contribuem para a resposta citotóxica induzida pela cromomicina A2. Discussão: A identificação de genes envolvidos no reparo de DNA, apoptose, proteostase e metabolismo demonstra que a atividade antitumoral da cromomicina A2 depende da integração de diferentes vias responsáveis pela manutenção da homeostase celular. Esses achados corroboram os resultados funcionais obtidos anteriormente e fornecem novas evidências sobre os mecanismos moleculares associados à resposta ao tratamento. Conclusão: O rastreamento funcional por CRISPR/Cas9 revelou vulnerabilidades genéticas associadas à resposta à cromomicina A2 em leucemias agudas, destacando vias de reparo de DNA, estresse celular e apoptose como determinantes da sensibilidade ao composto. Esses resultados ampliam a compreensão do mecanismo de ação da cromomicina A2 e identificam potenciais biomarcadores e alvos terapêuticos para futuras estratégias em neoplasias hematológicas.
SN - 2531-1379
SN - 2531-1387
ER -