TRIAGEM QUIMIOGENÔMICA POR CRISPR/CAS9 IDENTIFICA A HOMEOSTASE MITOCONDRIAL COMO RELEVANTE PARA A RESPOSTA À CEFALOCROMINA NA LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA
- 1Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
- 2Université de Montréal, Canadá
Abstract
Introdução: A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é uma neoplasia hematológica caracterizada pela proliferação descontrolada de linfoblastos, cuja taxa de recidiva permanece elevada em adultos, evidenciando a necessidade de novas estratégias terapêuticas. Produtos naturais constituem uma importante fonte de agentes antineoplásicos, como os alcaloides da vinca e as antraciclinas. A cefalocromina (CPC), metabólito fúngico produzido por Alternaria sp. e Cosmopora vilior, apresenta atividade antitumoral em diferentes modelos experimentais. Em estudos prévios, demonstramos que a CPC reduz a viabilidade e a capacidade clonogênica de células de LLA, induz parada do ciclo celular, apoptose, dano ao DNA e autofagia, além de potencializar os efeitos da daunorrubicina e da vincristina. Entretanto, os determinantes genéticos responsáveis pela resposta celular à CPC permanecem desconhecidos. Objetivo: Identificar os genes envolvidos na sensibilidade e resistência à CPC por meio de chemogenomic screening baseado em CRISPR/Cas9 na linhagem NALM6, complementado pela avaliação da expressão de genes relacionados aos mecanismos de ação da CPC em modelos de LLA. Métodos: Um painel de genes relacionados ao ciclo celular, apoptose, dano ao DNA e autofagia foi avaliado por RT-qPCR em células Jurkat, NALM6 e REH tratadas com veículo ou CPC (2,5 µM/48 h). Para o chemogenomic screening, clones da linhagem NALM6 expressando Cas9 Tet-ON e biblioteca EKO de sgRNAs foram induzidos com doxiciclina, tratados com veículo ou CPC (1 µM) e submetidos ao sequenciamento por NGS. Genes enriquecidos nos clones resistentes foram identificados utilizando False Discovery Rate (Benjamini-Hochberg; q<0,05). Resultados e Discussão: A CPC promoveu redução da expressão de genes associados à progressão do ciclo celular (CCNA2, CCNB1, CCNE1) e à sobrevivência celular (BIRC5), acompanhada pelo aumento da expressão de genes envolvidos na inibição do ciclo celular (CDKN1A, CDKN1B), resposta ao dano ao DNA (GADD45A), apoptose (BAX, BAK1, BAD, BNIP3, BNIP3L, PMAIP1, BBC3) e autofagia (ATG5, BECN1, SQSTM1 e MAP1LC3B). O chemogenomic screening identificou 11 genes cuja perda conferiu resistência à CPC (ATIC, CCNL1, CDV3, EIF3F, EDRF1, EIF4A1, ENY2, OMA1, RIC1, SNN e STARD7), revelando potenciais mediadores da resposta ao tratamento. Destaca-se a identificação de OMA1 e STARD7, genes envolvidos na homeostase e função mitocondrial, sugerindo que a integridade mitocondrial constitui um determinante crítico da citotoxicidade induzida pela CPC. Além disso, genes relacionados ao metabolismo celular, tradução proteica e regulação transcricional reforçam que a resposta à CPC depende da integração de múltiplas vias celulares. Conclusão: O chemogenomic screening por CRISPR/Cas9 identificou novos determinantes genéticos da resposta à CPC em LLA, destacando genes relacionados à homeostase mitocondrial como potenciais mediadores de sua atividade antitumoral. Em conjunto, os resultados indicam que a CPC exerce seus efeitos por meio da modulação coordenada de vias de dano ao DNA, apoptose, autofagia e metabolismo mitocondrial, fornecendo novos alvos para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas em LLA. Apoio: FAPESP, CNPq e CAPES.
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AB - Introdução: A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é uma neoplasia hematológica caracterizada pela proliferação descontrolada de linfoblastos, cuja taxa de recidiva permanece elevada em adultos, evidenciando a necessidade de novas estratégias terapêuticas. Produtos naturais constituem uma importante fonte de agentes antineoplásicos, como os alcaloides da vinca e as antraciclinas. A cefalocromina (CPC), metabólito fúngico produzido por Alternaria sp. e Cosmopora vilior, apresenta atividade antitumoral em diferentes modelos experimentais. Em estudos prévios, demonstramos que a CPC reduz a viabilidade e a capacidade clonogênica de células de LLA, induz parada do ciclo celular, apoptose, dano ao DNA e autofagia, além de potencializar os efeitos da daunorrubicina e da vincristina. Entretanto, os determinantes genéticos responsáveis pela resposta celular à CPC permanecem desconhecidos. Objetivo: Identificar os genes envolvidos na sensibilidade e resistência à CPC por meio de chemogenomic screening baseado em CRISPR/Cas9 na linhagem NALM6, complementado pela avaliação da expressão de genes relacionados aos mecanismos de ação da CPC em modelos de LLA. Métodos: Um painel de genes relacionados ao ciclo celular, apoptose, dano ao DNA e autofagia foi avaliado por RT-qPCR em células Jurkat, NALM6 e REH tratadas com veículo ou CPC (2,5 µM/48 h). Para o chemogenomic screening, clones da linhagem NALM6 expressando Cas9 Tet-ON e biblioteca EKO de sgRNAs foram induzidos com doxiciclina, tratados com veículo ou CPC (1 µM) e submetidos ao sequenciamento por NGS. Genes enriquecidos nos clones resistentes foram identificados utilizando False Discovery Rate (Benjamini-Hochberg; q<0,05). Resultados e Discussão: A CPC promoveu redução da expressão de genes associados à progressão do ciclo celular (CCNA2, CCNB1, CCNE1) e à sobrevivência celular (BIRC5), acompanhada pelo aumento da expressão de genes envolvidos na inibição do ciclo celular (CDKN1A, CDKN1B), resposta ao dano ao DNA (GADD45A), apoptose (BAX, BAK1, BAD, BNIP3, BNIP3L, PMAIP1, BBC3) e autofagia (ATG5, BECN1, SQSTM1 e MAP1LC3B). O chemogenomic screening identificou 11 genes cuja perda conferiu resistência à CPC (ATIC, CCNL1, CDV3, EIF3F, EDRF1, EIF4A1, ENY2, OMA1, RIC1, SNN e STARD7), revelando potenciais mediadores da resposta ao tratamento. Destaca-se a identificação de OMA1 e STARD7, genes envolvidos na homeostase e função mitocondrial, sugerindo que a integridade mitocondrial constitui um determinante crítico da citotoxicidade induzida pela CPC. Além disso, genes relacionados ao metabolismo celular, tradução proteica e regulação transcricional reforçam que a resposta à CPC depende da integração de múltiplas vias celulares. Conclusão: O chemogenomic screening por CRISPR/Cas9 identificou novos determinantes genéticos da resposta à CPC em LLA, destacando genes relacionados à homeostase mitocondrial como potenciais mediadores de sua atividade antitumoral. Em conjunto, os resultados indicam que a CPC exerce seus efeitos por meio da modulação coordenada de vias de dano ao DNA, apoptose, autofagia e metabolismo mitocondrial, fornecendo novos alvos para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas em LLA. Apoio: FAPESP, CNPq e CAPES.
SN - 2531-1379
SN - 2531-1387
ER -