ALTERAÇÕES FUNCIONAIS DA HEMOGLOBINA EM PACIENTE COM ERITROCITOSE E SEM A PRESENÇA DE VARIANTES PATOGÊNICAS DETERMINADAS
- 1Laboratório de Hemoglobinopatias (LabHb), Departamento de Patologia, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brasil
- 2Centro de Hematologia e Hemoterapia (Hemocentro), Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brasil
- 3Instituto Nacional de Câncer (INCA), Campos dos Goytacazes, RJ, Brasil
Abstract
Introdução: A eritrocitose é caracterizada pelo aumento da massa eritrocitária e dos níveis de hemoglobina (Hb) e hematócrito (Ht). Subdividida em causas primárias, decorrentes de alterações clonais ou genéticas, e causas secundárias, motivadas por fatores extrínsecos como hipóxia tecidual (associada ao tabagismo, cardiopatias e pneumopatias) ou secreção aumentada de eritropoetina decorrente de tumores produtores de eritropoetina ou uso de anabolizantes androgênicos. Após exaustiva investigação clínica e laboratorial, alguns casos permanecem sem esclarecimento. Para estes, o painel de NGS dos genes envolvidos na eritrocitose bem como estudos funcionais da Hb tornam-se ferramentas na elucidação de casos complexos. Relato de caso: Paciente do sexo masculino, 42 anos, não fumante, sem alterações cardiopulmonares ou renais, cariótipo 46,XY, apresentou valores de Hb entre 18,7 g/dL e 29,4 g/dL e Ht entre 53,9% e 58,4%, compatíveis com eritrocitose. A investigação inicial incluiu pesquisa da mutação em JAK2, com resultado negativo. Em 2020, a avaliação da medula óssea evidenciou discreta hipercelularidade, com leve panmielose envolvendo as linhagens eritroide, granulocítica e megacariocítica, além de maturação hematopoética preservada, levantando a hipótese de doença mieloproliferativa crônica. Em 2024, nova avaliação medular demonstrou medula óssea normocelular e normomaturativa, com importante hiperplasia da série eritroide, confirmada por imunomarcação positiva para CD71. Painel de Next Generation Sequencing (NGS) para eritrocitose, composto por 22 genes [BPGM, CALR, EGLN1, EGLN2, EPAS1, EPO, EPOR, HIF1A, HIF3A, HSF1, JAK2, MITF, MPL, P4HTM, SH2B3, VHL, FH, HBB, BHLHEA1, OS9, região codificante parcial de HBA1 (éxon 2 parcial e éxon 3), HBA2 (éxon 2 parcial e éxon 3), e região promotora de EPO] não apontou para nenhuma variante genética (SNV).Sequenciamento direto dos genes HBB, HBA1 e HBA2 e análises proteicas da Hb (HPLC, Variant II- BioRad; RP-HPLC, Alliance, Waters) também não apontaram para qualquer alteração na Hb ou nos genes que a sintetizam. Estudo funcional da Hb purificada (stripped; [Hb]= 70uM/Hb) por cromatografias de exclusão molecular (Sephadex 25G, Sigma-Aldrich) em tampão HEPES (50mM, Sigma-aldrich) seguidas por cromatografia de troca iônica (Amberlite MB3, Sigma Aldrich), não resultou em alterações significativas de p50 nos pHs 6,5, 7,5 e 8,5, em relação às amostras controle. Em contrapartida, as p50 encontradas na presença do efetor alostérico IHP (1mM, Sigma-Aldrich), mimético do 2,3-BPG, resultaram em valores reduzidos, o que apontam para significativo aumento de afinidade pelo O2 (paciente: 7,3 mmHg ± 1,3 versus controles: 13,3 mmHg ± 4,7). Não foram observadas alterações de Bohr. Cooperatividade heme-heme, também não apontaram para diferenças significativas, apesar da tendência à redução. Conclusão: O painel NGS foi fundamental para excluir as principais causas conhecidas da eritrocitose, enquanto que o estudo funcional da Hb purificada apontou para comportamento funcional anômalo apesar da ausência de alterações na proteína ou mutações nos genes de globina. Tais achados, apontam para potenciais alterações no alosterismo proteico. Como perspectiva futura, serão realizados estudos de proteômica e metabolômica de modo a identificar potenciais interferentes que resultem no aumento da afinidade da Hb pelo O2. Apoio financeiro: CAPES, FAPESP e FAEPEX.
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AB - Introdução: A eritrocitose é caracterizada pelo aumento da massa eritrocitária e dos níveis de hemoglobina (Hb) e hematócrito (Ht). Subdividida em causas primárias, decorrentes de alterações clonais ou genéticas, e causas secundárias, motivadas por fatores extrínsecos como hipóxia tecidual (associada ao tabagismo, cardiopatias e pneumopatias) ou secreção aumentada de eritropoetina decorrente de tumores produtores de eritropoetina ou uso de anabolizantes androgênicos. Após exaustiva investigação clínica e laboratorial, alguns casos permanecem sem esclarecimento. Para estes, o painel de NGS dos genes envolvidos na eritrocitose bem como estudos funcionais da Hb tornam-se ferramentas na elucidação de casos complexos. Relato de caso: Paciente do sexo masculino, 42 anos, não fumante, sem alterações cardiopulmonares ou renais, cariótipo 46,XY, apresentou valores de Hb entre 18,7 g/dL e 29,4 g/dL e Ht entre 53,9% e 58,4%, compatíveis com eritrocitose. A investigação inicial incluiu pesquisa da mutação em JAK2, com resultado negativo. Em 2020, a avaliação da medula óssea evidenciou discreta hipercelularidade, com leve panmielose envolvendo as linhagens eritroide, granulocítica e megacariocítica, além de maturação hematopoética preservada, levantando a hipótese de doença mieloproliferativa crônica. Em 2024, nova avaliação medular demonstrou medula óssea normocelular e normomaturativa, com importante hiperplasia da série eritroide, confirmada por imunomarcação positiva para CD71. Painel de Next Generation Sequencing (NGS) para eritrocitose, composto por 22 genes [BPGM, CALR, EGLN1, EGLN2, EPAS1, EPO, EPOR, HIF1A, HIF3A, HSF1, JAK2, MITF, MPL, P4HTM, SH2B3, VHL, FH, HBB, BHLHEA1, OS9, região codificante parcial de HBA1 (éxon 2 parcial e éxon 3), HBA2 (éxon 2 parcial e éxon 3), e região promotora de EPO] não apontou para nenhuma variante genética (SNV).Sequenciamento direto dos genes HBB, HBA1 e HBA2 e análises proteicas da Hb (HPLC, Variant II- BioRad; RP-HPLC, Alliance, Waters) também não apontaram para qualquer alteração na Hb ou nos genes que a sintetizam. Estudo funcional da Hb purificada (stripped; [Hb]= 70uM/Hb) por cromatografias de exclusão molecular (Sephadex 25G, Sigma-Aldrich) em tampão HEPES (50mM, Sigma-aldrich) seguidas por cromatografia de troca iônica (Amberlite MB3, Sigma Aldrich), não resultou em alterações significativas de p50 nos pHs 6,5, 7,5 e 8,5, em relação às amostras controle. Em contrapartida, as p50 encontradas na presença do efetor alostérico IHP (1mM, Sigma-Aldrich), mimético do 2,3-BPG, resultaram em valores reduzidos, o que apontam para significativo aumento de afinidade pelo O2 (paciente: 7,3 mmHg ± 1,3 versus controles: 13,3 mmHg ± 4,7). Não foram observadas alterações de Bohr. Cooperatividade heme-heme, também não apontaram para diferenças significativas, apesar da tendência à redução. Conclusão: O painel NGS foi fundamental para excluir as principais causas conhecidas da eritrocitose, enquanto que o estudo funcional da Hb purificada apontou para comportamento funcional anômalo apesar da ausência de alterações na proteína ou mutações nos genes de globina. Tais achados, apontam para potenciais alterações no alosterismo proteico. Como perspectiva futura, serão realizados estudos de proteômica e metabolômica de modo a identificar potenciais interferentes que resultem no aumento da afinidade da Hb pelo O2. Apoio financeiro: CAPES, FAPESP e FAEPEX.
SN - 2531-1379
SN - 2531-1387
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