DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO ANALÍTICA DE UM ENSAIO DE qPCR DUPLEX PARA DETECÇÃO RÁPIDA DE MICOPLASMA EM PRODUTOS DE TERAPIA CELULAR AVANÇADA
- 1Faculdade de Medicina de Ribeirao Preto (FMRP), Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP, Brasil
- 2Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto, Ribeirão Preto, SP, Brasil
Abstract
Introdução: O desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico molecular é essencial para promover inovação tecnológica no monitoramento da qualidade e da segurança durante as etapas de produção e liberação de produtos destinados à terapia celular avançada. Este estudo teve como objetivo desenvolver um ensaio de qPCR para detecção rápida de contaminação por micoplasma em produtos de terapia celular avançada. Material e métodos: Foi realizado o alinhamento de sequências de diferentes espécies da classe Mollicutes, seguido de análise in silico para definição da região-alvo e seleção dos primers e sondas para detecção de micoplasma. O gene humano RPP30 foi utilizado como controle interno. Foram avaliados dois métodos de extração de DNA, manual (Microsart® AMP Extraction, Sartorius) e automatizado (Extracta® Kit – DNA e RNA de Patógenos, Loccus), além de três reagentes de amplificação por qPCR (Amplio MasterMix qPCR 2X MDx Standard, (No UDG) e UltraFast, Loccus). O desempenho do ensaio foi investigado com sete combinações de primers e sondas, utilizando padrões comerciais de micoplasmas e de microrganismos não pertencentes à classe Mollicutes. Resultados: Duas combinações de primers e sondas apresentaram amplificação adequada para os alvos micoplasma e RPP30, tanto em reações singleplex quanto duplex. Amostras positivas apresentaram amplificação simultânea dos dois alvos após extração manual e automatizada. Nas amostras negativas foi observada apenas a amplificação de RPP30, confirmando a integridade da amostra, a eficiência da extração e o adequado desempenho da qPCR. Não foram observadas diferenças significativas entre os três reagentes de amplificação avaliados, que apresentaram perfis semelhantes. O método de extração automatizada associado ao ensaio de qPCR detectou 10 CFU/mL de Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma pneumoniae e Mycoplasma orale. A especificidade analítica foi avaliada utilizando DNA de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus acidophilus e Streptococcus pneumoniae. Não houve amplificação para L. acidophilus, porém foi observada reação cruzada com C. acetobutylicum e S. pneumoniae. Conclusão: O ensaio permitiu a detecção simultânea de micoplasma e do controle interno RPP30 em uma única reação de qPCR. A sensibilidade analítica atendeu aos requisitos da Farmacopeia Europeia, permitindo a detecção de 10 CFU/mL de A. laidlawii, M. pneumoniae e M. orale. Entretanto, a especificidade foi insuficiente para a detecção exclusiva de micoplasmas. Assim, embora o método apresente elevada sensibilidade, são necessários ajustes no desenho dos oligonucleotídeos para aumentar sua especificidade e reduzir reações cruzadas.
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BibTeX
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RIS
TY - JOUR
TI - DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO ANALÍTICA DE UM ENSAIO DE qPCR DUPLEX PARA DETECÇÃO RÁPIDA DE MICOPLASMA EM PRODUTOS DE TERAPIA CELULAR AVANÇADA
AU - Evandra Strazza RODRIGUES
AU - Josiane Serrano BORGES
AU - Graciely Gomides GOBO
AU - Natália Testa FERNANDES
AU - Fabiola TRAINA
AU - Rodrigo T CALADO
AU - Simone KASHIMA
PY - 2026
DA - 2026/10/23
JO - Hematology, Transfusion and Cell Therapy
DO - 10.1016/j.htct.2026.106849
UR - https://doi.org/10.1016/j.htct.2026.106849
AB - Introdução: O desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico molecular é essencial para promover inovação tecnológica no monitoramento da qualidade e da segurança durante as etapas de produção e liberação de produtos destinados à terapia celular avançada. Este estudo teve como objetivo desenvolver um ensaio de qPCR para detecção rápida de contaminação por micoplasma em produtos de terapia celular avançada. Material e métodos: Foi realizado o alinhamento de sequências de diferentes espécies da classe Mollicutes, seguido de análise in silico para definição da região-alvo e seleção dos primers e sondas para detecção de micoplasma. O gene humano RPP30 foi utilizado como controle interno. Foram avaliados dois métodos de extração de DNA, manual (Microsart® AMP Extraction, Sartorius) e automatizado (Extracta® Kit – DNA e RNA de Patógenos, Loccus), além de três reagentes de amplificação por qPCR (Amplio MasterMix qPCR 2X MDx Standard, (No UDG) e UltraFast, Loccus). O desempenho do ensaio foi investigado com sete combinações de primers e sondas, utilizando padrões comerciais de micoplasmas e de microrganismos não pertencentes à classe Mollicutes. Resultados: Duas combinações de primers e sondas apresentaram amplificação adequada para os alvos micoplasma e RPP30, tanto em reações singleplex quanto duplex. Amostras positivas apresentaram amplificação simultânea dos dois alvos após extração manual e automatizada. Nas amostras negativas foi observada apenas a amplificação de RPP30, confirmando a integridade da amostra, a eficiência da extração e o adequado desempenho da qPCR. Não foram observadas diferenças significativas entre os três reagentes de amplificação avaliados, que apresentaram perfis semelhantes. O método de extração automatizada associado ao ensaio de qPCR detectou 10 CFU/mL de Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma pneumoniae e Mycoplasma orale. A especificidade analítica foi avaliada utilizando DNA de Clostridium acetobutylicum, Lactobacillus acidophilus e Streptococcus pneumoniae. Não houve amplificação para L. acidophilus, porém foi observada reação cruzada com C. acetobutylicum e S. pneumoniae. Conclusão: O ensaio permitiu a detecção simultânea de micoplasma e do controle interno RPP30 em uma única reação de qPCR. A sensibilidade analítica atendeu aos requisitos da Farmacopeia Europeia, permitindo a detecção de 10 CFU/mL de A. laidlawii, M. pneumoniae e M. orale. Entretanto, a especificidade foi insuficiente para a detecção exclusiva de micoplasmas. Assim, embora o método apresente elevada sensibilidade, são necessários ajustes no desenho dos oligonucleotídeos para aumentar sua especificidade e reduzir reações cruzadas.
SN - 2531-1379
SN - 2531-1387
ER -